Direct identification of bovine mastitis pathogens by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in pre-incubated milk

ABSTRACT The present study aimed to compare two MALDI-TOF identification methods [(a) direct sample identification after pre-incubation; or (b) use of bacteria isolated on pre-culture)] to standard, traditional bench microbiology. A total of 120 quarter milk samples from 40 Holstein lactating cows were screened based on culture-positive results obtained by microbiological culture (reference method) with the following numbers of quarters positive per cow: 4 cows with 1, 8 cows with 2, 12 cows with 3 and 16 cows with 4 infected quarters per cow. For direct identification method, quarter milk samples (n = 120) were skimmed by centrifugation (10,000 × g/10 min) and pre-incubated at 37 ºC for 12 h. After pre-incubation, quarter milk samples were submitted to total bacterial count by flow cytometry and for a preparation protocol for bacterial ribosomal protein extraction followed by MALDI-TOF MS analysis. The direct MALDI-TOF MS identification method compared to microbiological culture correctly identified isolates of coagulase-negative Staphylococci (27.2%), Streptococcus agalactiae (21.8%), Staphylococcus aureus (14.2%), and Streptococcus uberis (5.2%). The pre-incubation protocol of milk samples, associated to the direct identification method by MALDI-TOF MS, did not increase the identification at species level (score >2.0) of pathogens causing subclinical mastitis in comparison to the method without previous incubation.

Rapid identification of bovine mastitis pathogens by MALDI-TOF Mass Spectrometry / Rápida identificação de agentes causadores de mastite por espectrometria de massas MALDI-TOF

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) has been shown to be an alternative method for identification of bacteria via their protein profile spectra, being able to identify bacteria at the genus, species and even at subspecies level. With the aim of large-scale identification of pathogens causing mastitis by this platform, a total of 305 isolates of bacteria identified from cows with subclinical mastitis were analyzed by conventional microbiological culture (MC) as well as by MALDI-TOF MS coupled with Biotyper data processing. Approximately 89% of the identifications performed by MALDI-TOF MS were consistent with results obtained by MC. From the remaining isolates (11%), 6.3% of isolates were classified as misidentified (discordance for both genus and species level), and 4.7% showed identification agreement at the genus level but not at the species level, being classified as unidentified at species level. The disagreement results were mostly associated with identification of Streptococcus and Enterococcus species probably due to the narrow phenotypic similarity between these two genera. These disagreement results suggest that biochemical assays might be prone to identification errors and, MALDI-TOF MS therefore may be an alternative to overcome incorrect species-specific identification. Standard microbiological methods for bovine mastitis diagnosis are time consuming, laborious and prone to errors for some bacteria genera. In our study, we showed that MALDI-TOF MS coupled with Biotyper may be an alternative method for large-scale identification of bacteria isolated from milk samples compared to classical microbiological routine protocols.(AU)

A espectrometria de massas (MALDI-TOF MS) tem mostrado ser um método alternativo para a identificação de bactérias, sendo capaz de identificar as bactérias causadoras de mastite em gênero, espécie ou até mesmo subespécie. Com o objetivo de identificar os patógenos causadores de mastite em grande-escala por esta plataforma, um total de 305 isolados bacterianos oriundos de vacas com mastite subclínica foram analisados pela cultura microbiológica convencional (CM) e pela MALDI-TOF MS acoplada ao software Biotyper. Aproximadamente 89% das identificações realizadas pela MALDI-TOF MS foram consistentes com os resultados obtidos pela CM. Do restante de isolados bacterianos (11%), 6,3% foram classificados como identificação errônea (discordância de gênero e espécie), e 4,7% apresentaram concordância de gênero, mas discordância da espécie. Os resultados que apresentaram divergência estavam mais associados com a identificação das espécies de Streptococcus spp. e Enterococcus spp. devido à similaridade fenotípica entre os dois gêneros. Estes resultados divergentes sugerem que os ensaios bioquímicos podem ser propensos a erros de identificação, por isso a MALDI-TOF MS pode ser considerada um método alternativo para superar os erros de identificação da CM. A cultura microbiológica padrão e os ensaios bioquímicos utilizados na identificação de agentes causadores de mastite são demorados, trabalhosos e propensos a erros quando utilizados na identificação em nível de espécie. No presente estudo, demonstramos que a MALDI-TOF MS acoplada ao software Biotyper pode ser considerada um método alternativo de identificação de bactérias causadoras de mastite em grande-escala quando comparado com a cultura microbiológica convencional.(AU)

Risk factors associated with the antimicrobial resistance of Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis / Fatores de risco associados com a resistência antimicrobiana de Staphylococcus aureus isolados da mastite bovina

The objective of this study was to evaluate herd management practices and mastitis treatment procedures as risk factors associated with Staphylococcus aureus antimicrobial resistance. For this study, 13 herds were selected to participate in the study to evaluate the association between their management practices and mastitis treatment procedures and in vitro antimicrobial susceptibility. A total of 1069 composite milk samples were collected aseptically from the selected cows in four different periods over two years. The samples were used for microbiological culturing of S. aureus isolates and evaluation of their antimicrobial susceptibility. A total of 756 samples (70.7%) were culture-positive, and S. aureus comprised 27.77% (n=210) of the isolates. The S. aureus isolates were tested using the disk-diffusion susceptibility assay with the following antimicrobials: ampicillin 10mg; clindamycin 2μg; penicillin 1mg; ceftiofur 30μg; gentamicin 10mg; sulfa-trimethoprim 25μg; enrofloxacin 5μg; sulfonamide 300μg; tetracycline 30μg; oxacillin 1mg; cephalothin 30μg and erythromycin 5μg. The variables that were significantly associated with S. aureus resistance were as follows: the treatment of clinical mastitis for ampicillin (OR=2.18), dry cow treatment for enrofloxacin (OR=2.11) and not sending milk samples for microbiological culture and susceptibility tests, for ampicillin (OR=2.57) and penicillin (OR=4.69). In conclusion, the identification of risk factors for S. aureus resistance against various mastitis antimicrobials is an important information that may help in practical recommendations for prudent use of antimicrobial in milk production.

Objetivou-se com este estudo avaliar os fatores de risco associados às práticas de manejo e tratamento de mastite e a resistência aos antimicrobianos de Staphylococcus aureus isolados de vacas com mastite. Foram selecionados para o presente estudo 13 rebanhos localizados na região de Pirassununga/SP. Foi aplicado um questionário contendo informações para o levantamento de fatores de risco relacionados à resistência aos antimicrobianos e às práticas de manejo e tratamento de mastite. Após a seleção dos rebanhos e aplicação dos questionários, foram utilizados 210 isolados de S. aureus de amostras compostas de leite coletadas durante 24 meses, em quatro períodos, para realização dos testes de resistência. Os antimicrobianos testados foram: ampicilina 10µg, clindamicina 2µg, penicilina 1µg, eftiofour 30µg, gentamicina 10µg, sulfatrimetropin 25µg, enrofloxacina 5µg, sulfonamida 300µg, tetraciclina 30µg, oxacilina 1µg, cefalotina 30µg e eritromicina 5µg. As variáveis que foram significativamente associadas à resistência de S. aureus foram: o tratamento da mastite clínica para ampicilina (OR = 2,18), o tratamento da vaca seca para enrofloxacina (OR=2,11), e o não envio de amostras de leite para a cultura microbiológica e testes de sensibilidade, para ampicilina (OR=2,57) e penicilina (OR=4,69). Em conclusão, a identificação dos fatores de risco para a resistência S. aureus frente aos principais agentes antimicrobianos, utilizados para tratamento da mastite, pode auxiliar o estabelecimento do uso prudente de antimicrobianos na produção de leite.

Perfil de sensibilidade microbiana in vitro de linhagens de Staphylococcus spp. isoladas de vacas com mastite subclínica / In vitro antimicrobial sensitivity to Staphylococcus spp. isolates from dairy cows with subclinical mastitis

Objetivou-se com este estudo avaliar a sensibilidade antimicrobiana in vitro de 291 isolados de Staphylococcus spp. recuperados de amostras de leite de vacas com mastite subclínica, em 15 propriedades rurais localizadas na Região Metropolitana do Recife (A), Agreste (B) e Zona da Mata (C) do estado de Pernambuco. Dos 291 isolados, 170(58,4 por cento) foram classificados como Staphylococcus coagulase negativa (SCN), 84(28,9 por cento) como Staphylococcus aureus e 37(12,7 por cento) como Staphylococcus coagulase positiva (SCP). Para o estudo do perfil de sensibilidade a antimicrobianos empregou-se a técnica de difusão em discos, foram avaliadas 16 drogas antimicrobianas utilizadas no tratamento das mastites. O antibiótico que apresentou melhor eficácia in vitro foi a associação entre neomicina + bacitracina + tetraciclina com percentuais de 98,4 por cento, 99,3 por cento, 89,7 por cento para as regiões A, B e C, respectivamente. O antibiótico menos eficaz foi a ampicilina que apresentou 56,5 por cento de resistência para as amostras da região A, 72,8 por cento para a região B e 71,8 por cento na região C. Os resultados obtidos mostram a necessidade da realização periódica de testes de sensibilidade in vitro, pois existem variações no perfil de sensibilidade e resistência que podem comprometer o tratamento do animal bem como os programas de controle da mastite bovina causada pelo Staphylococcus spp.

The objective of the investigation was to evaluate the in vitro antimicrobial sensibility of 291 isolates of Staphylococcus spp., taken from the mammary glands of dairy cows with subclinical mastitis in the regions of Metropolitan Recife (A), Agreste (B) and Zona da Mata (C) in the state of Pernambuco, Brazil. From the 291 isolates, 170 (58.4 percent) were identified as negative coagulase Staphylococcus (SCN), 84 (28.9 percent) as Staphylococcus aureus, and 37 (12.7 percent) as positive coagulase Staphylococcus (SCP). To study sensitivity to antimicrobials, the diffusion in disks method was used with 16 antimicrobial drugs commonly employed in the treatment of mastitis. The most efficient antibiotic in vitro was the combination of neomicine + bacitracine + tetracycline with percentages of 98.4 percent, 99.3 percent, and 89.7 percent for the A, B, and C regions, respectively. The least efficient was ampicillin, which was resistant to 56.5 percent of the isolates taken from region A, 72.8 percent from region B, and 71.8 percent from region C. These results indicate the need for periodic testing of sensitivity in vitro, as these variations can compromise the treatment of animals as well as control programs for bovine mastitis caused by Staphylococcus spp.

Vigilância epidemiológica da sífilis na gravidez no Centro de Saúde do Bairro Uruará-área verde / Epidemiological surveillance on syphilis in the pregnancy at Centro de Saúde do Uruará-área verde district

Introdução: a sífilis é causa de grande morbidade na vida intra-uterina, com efeitos desastrosos para o feto e negativos para a gestação, o que representa um problema de saúde pública no grupo materno-infantil, prioritário na política do Ministério da Saúde (MS). Objetivo: avaliar a vigilância epidemiológica da sífilis na gravidez no centro de saúde do bairro Uruará-Área Verde, em Santarém, Pará, Brasil. Métodos: realizou-se um estudo transversal dos prontuários de 143 gestantes acompanhadas no serviço de pré-natal, tomando como amostra todas as grávidas atendidas no período de1º de fevereiro a 31 de maio de 2007. A efetividade da vigilância foi relacionada com a preconizada pelo MS, referente à solicitação do teste não-treponêmico (VDRL) correlacionado com idade gestacional de adesão ao programa, número de gestações, partos e abortamentos anteriores. Resultados: na amostra considerada, observou-se: amplitude da idade materna de 14 a 37 anos; 56 gestantes < 20 anos; 23 (16,1%) com histórias clínicas de abortamentos anteriores; 114 (79,7%) iniciaram o pré-natal a partir da 13a semana de gravidez; em 140 (97,9%) foi solicitado o teste na inscrição e em 1 (uma) não houve solicitação de nenhum teste. Conclusões: os dados deste estudo mostram que é possível avaliar a vigilância da sífilis na gravidez mediante o monitoramento da sorologia para sífilis (e deste modo avaliar o próprio pré-natal), o que constitui um instrumento efetivo para dimensionar a magnitude do agravo, orientar ações de vigilância, controle e eliminação da sífilis congênita na população da unidade, sendo passível de expansão para todo o município.

Introduction: syphilis is the cause of great morbidity in the intrauterine life, with disastrous effect for the embryo and negatives for gestation, representing a problem of public health in the maternal-infantile, a priority group for the Ministry of Health politics. Objective: to evaluate epidemiologicalsurveillance on syphilis in the pregnancy, a cross sectional study was conducted from 143 handbooks of pregnant women supported by prenatalservice in the period of February 1st to May 31st 2007, in the community of Centro de Saúde do Uruará - Área Verde district, Santarem, Pará, Brazil.Methods: the effectiveness of the surveillance was related with the one indicated by the Ministry of Health, referring to non-treponemic test (VDRL)request according to maternal age of adhesion to the program, numbers of previous childbirths and abortions. Results: from the considered samples:maternal age extension ranged from 14 to 37 years-olds, there were 56 pregnant women under 20 years-old; 23 (16,1%) with clinical histories of previous abortions; 114 (79,7%) enrolled the prenatal service from the 13th week of pregnancy; treponemic test was requested to 140 women (97,9%) but for one was not asked to do any test. Conclusions: the data of this study show the possibility of evaluating syphilis surveillance in pregnancy fromserological tests in mothers (as well as prenatal service) as an effective indicative signal of the problem, guiding health surveillance practices as anattempt to control and eliminate congenital syphilis in the community analyzed and also in the city.